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本发明公开了用于构建中棉所50指纹图谱的SSR引物及其应用，属于中棉所50的分子生物学鉴定领域。本发明根据GenBank dbEST数据库及专业棉花数据库CMD上释放获得的棉花EST序列数据设计并初步筛选获得268对SSR引物。本发明在上述268对引物中筛选获得106对具有差异效果的引物。本发明进一步对上述106对引物进行筛选，选出差异较为稳定、多态性好的15对核心引物，加上一对Bt基因特异引物，用于构建中棉所50的特异指纹图谱。本发明还公开了所述SSR引物在构建中棉所50指纹图谱以及鉴定中棉所50中的应用。本发明所述SSR引物及所构建的指纹图谱对中棉所50的品种鉴定与推广等具有重要价值。